Jahrelang litt Luther an Krankheiten. Zwischen 1531 und 1546 verschlechterte sich seine Gesundheit weiter. Der mehrjährige Kampf mit Rom, der Widerstreit mit und zwischen seinen Mitreformern und der Skandal, der aus der Doppelehe Philips I. von Hessen folgte, bei dem Luther eine wichtige Rolle spielte, haben wahrscheinlich alle zu seinem angeschlagenen Gesundheitszustand beigetragen. Ab 1536 litt er unter Nieren- und Blasensteinen und Arthritis; eine Ohreninfektion zerriss zudem ein Trommelfell. Im Dezember 1544 begann er, die Auswirkungen einer Angina zu spüren.
Seine körperliche Gesundheit machte ihn reizbar und seine Schriften und Kommentare noch barscher. Luthers Ehefrau Katharina soll gesagt haben: „Lieber Ehemann, Sie sind allzu grob“, worauf er antwortete: „Man bringt mir bei, grob zu sein.“
Am 15. Februar 1546, drei Tage vor seinem Tod, hielt er in seinem Geburtsort Eisleben seine letzte Predigt. Laut Léon Poliakov „widmete diese sich ganz den verstockten Juden, welche vordringlich vom deutschen Territorium vertrieben werden sollten.“ James Mackinnon schreibt, dass sie mit der „glühenden Aufforderung“ schloss, „die Juden mit Sack und Pack aus ihrer Mitte zu jagen, es sei denn, sie würden von ihrer Verleumdung und Wucherei ablassen und Christen werden.“ Luther sagte: „Wir wollen ihnen gegenüber christliche Liebe ausüben und dafür beten, dass sie konvertieren“. Er sagte aber auch, dass sie „unsere öffentlichen Feinde“ seien; „… und wenn sie uns könnten alle töten, so täten sie es gerne und tun es auch oft.“
Seine letzte Reise trat Luther nach Mansfeld an, da er sich um die Zukunft der Familien seiner Geschwister sorgte, die den Beruf von Luthers Vater Hans im Kupferbergbau fortführten. Ihr Lebensunterhalt wurde von Graf Albrecht von Mansfeld bedroht, der die Industrie unter seine Kontrolle brachte.
Der folgende Meinungsstreit schloss alle vier Grafen von Mansfeld ein: Albrecht, Philip, Johann Georg und Gerhard. Ende 1545 reiste Luther zweimal nach Mansfeld, um an Verhandlungen zur Beilegung des Streits teilzunehmen. Ein dritter Besuch erfolgte im Frühjahr 1546 zur letztendlichen Beendigung.
Am 17. Februar 1546 wurden die Verhandlungen erfolgreich abgeschlossen. Nach 20 Uhr bekam Luther Schmerzen in der Brust. Als er zu Bett ging, betete er: „In deine Hände lege ich voll Vertrauen meinen Geist; du hast mich erlöst, Herr, du treuer Gott“ (Ps. 31,6). Es ist das Gebet der Sterbenden. Um 1 Uhr wachte er mit noch größeren Brustschmerzen auf und wurde mit heißen Tüchern gewärmt. Er dankte Gott dafür, dass er ihm seinen Sohn, an den er glaubte, offenbarte. Luthers Gefährten, Justus Jonas und Michael Coelius fragten ihn, ob er auf Christi Namen sterben und dessen Lehre bekennen wolle. Luther antwortete mit einem schlichten „Ja“.
Ein Schlaganfall beraubte ihn seiner Sprache. Kurze Zeit später, am 18. Februar 1546 um 2:45 Uhr, starb er in Eisleben, seiner Geburtsstadt, im Alter von 62 Jahren. Er wurde in der Schlosskirche in Wittenberg unter der Kanzel beerdigt.
Später fand man ein Stück Papier, auf das Luther seine letzten Worte geschrieben hatte. Die Worte waren, mit Ausnahme des deutschen Satzes „Wir sind Bettler“, in Latein verfasst.